17自從列文虎克**次看到活細(xì)胞以來，顯微成像技術(shù)已經(jīng)成為生物學(xué)領(lǐng)域的重要工具。

   

   

橙色球就是這次的新冠肺炎

   

從組織、細(xì)胞、細(xì)胞器到細(xì)胞蛋白，人類在科學(xué)道路上仍在尋找，對(duì)顯微技術(shù)的要求也越來越高。

   

不幸的是，光學(xué)顯微鏡通過簡(jiǎn)單的研磨鏡片制作已經(jīng)不能滿足需求，科學(xué)家們看到了新型冠狀病毒(以下簡(jiǎn)稱COVID-19）工具不是光學(xué)顯微鏡。

   

本文將首先解釋光學(xué)顯微鏡的困境，然后介紹兩種可以看到的方法COVID-19的顯微鏡。

   

光學(xué)顯微鏡

   

   

光路是黃色的

   

通過透鏡和小孔，光源出來的光攜帶樣品信息會(huì)在這些地方發(fā)生 衍射。

   

比如經(jīng)過小孔時(shí)，一束平行光應(yīng)被視為一列密集的點(diǎn)光源（下圖單縫處），點(diǎn)光源發(fā)出的球面波相互疊加后會(huì)出現(xiàn)明暗交替的同心圓環(huán)（ 艾里斑，下圖右上）。

   

   

這個(gè)過程類似于水波通過狹窄的縫隙反映光的波動(dòng)性。

   

   

雙縫衍射水波

   

如果我們想在顯微鏡下認(rèn)出它COVID-19，一束光不夠。至少要看病毒和周圍環(huán)境的界面。

   

假如COVID-19在顯微鏡光路衍射后，會(huì)形成兩個(gè)艾里斑，如果它們太近，就無法區(qū)分病毒和環(huán)境之間的差異。

   

   

原則上，包括光學(xué)顯微鏡在內(nèi)的任何顯微鏡，COVID-19與環(huán)境的距離小到一定程度后就無法區(qū)分了。這個(gè)距離可以用阿貝公式數(shù)字化解釋:

   

   

如果你想讓顯微鏡識(shí)別更近的兩點(diǎn)，你要縮小它們?chǔ)。

   

考慮照明光波長(zhǎng)（λ）在人眼可辨范圍內(nèi)（400-760nm），所以要讓?duì)更大，λ更小是400nm左右。

   

n它是光路介質(zhì)的折射率。一般來說，空氣n=1。另外，α是入射光角，理想是90°，這對(duì)任何顯微鏡都是一樣的，盡管它永遠(yuǎn)不會(huì)達(dá)到理想的情況。帶入阿貝公式計(jì)算，Δx更大值約為200nm。

   

   

考慮到病毒的直徑100nm左右，200nm分辨率肯定看不清楚。

   

阿貝公式告訴我們，我們想減少它Δx(增加分辨率)有兩種方法，一種是將病毒轉(zhuǎn)移到透鏡之間的介質(zhì)折射率n減是減少光的波長(zhǎng)。

   

更容易實(shí)現(xiàn)的就是把n有一種顯微技術(shù)叫做油浸物鏡。以折射率較高的油作為傳光介質(zhì)，可以使用n提高到1.4因此，普通光學(xué)顯微鏡和油浸物鏡的配合可以將分辨率提高到約150nm。

   

   

即使分辨率達(dá)到了，這個(gè)分辨率還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠100nm，只能說勉強(qiáng)能判斷病毒兩端的點(diǎn)，具體想看看病毒長(zhǎng)什么樣，分辨率不到5nm想都別想。

   

因此，我們應(yīng)該走另一條不同于降低折射率的道路：使用波長(zhǎng)較短的光源。

   

   

考慮到普通光學(xué)顯微鏡使用光子，自然會(huì)考慮是否可以用短波長(zhǎng)光子代替可見光，然后用傳感器收集光信號(hào)代替人眼觀察。

   

X例如，射線波長(zhǎng)足夠小Cu-Kα射線可以達(dá)到0.15個(gè)nm，可見光直接使用400nm三個(gè)數(shù)量級(jí)下降，分辨率自然大大提高。然而，這太理想化了。

   

實(shí)際上，X光源強(qiáng)度往往不夠大，傳感器無法測(cè)量足夠的數(shù)據(jù)，X射線光子難以聚焦，精確分析是幻想。

   

有趣的是，從 ** 5年倫琴用X射線開始拍攝各種物體，科學(xué)家們絞盡腦汁思考X當(dāng)光源顯示微鏡時(shí)，射線。

   

   

左:倫琴妻子的手，右:倫琴

   

但是，直到它的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手(本文的主角，拍攝COVID-19病毒)獲得諾貝爾獎(jiǎng)，X由于同步輻射光源、高性能檢測(cè)器和高性能檢測(cè)器，射線顯微鏡才真正制造出來。Fresnel使用波帶片。

   

大活人還能憋死尿嗎？X當(dāng)時(shí)的科學(xué)家干脆放棄用光子作為光源！

   

   

電子顯微鏡

   

由于需要短波長(zhǎng)的光源，因此更好使用電子。短波電子很容易獲得，只需給出足夠大的加速電壓。動(dòng)能上升后，根據(jù)德布羅的意義，波長(zhǎng)較短。

   

它們的波長(zhǎng)甚至可以達(dá)到0.1nm電子顯微鏡的分辨率也可以達(dá)到幾個(gè)水平nm，有足夠的分辨率觀察病毒。

   

   

電子槍原理

   

與聚光子相比，聚電子更容易。與光學(xué)玻璃鏡頭相比，電子顯微鏡使用的鏡頭是電磁鏡頭，其原理也非常簡(jiǎn)單。移動(dòng)電子將由磁場(chǎng)控制，磁場(chǎng)由電線圈創(chuàng)建，大小和方向可控。

   

此外，考慮到電子粒子性強(qiáng)，需要在整個(gè)光路上保持真空環(huán)境，否則電子束流不集中。這也更容易實(shí)現(xiàn)。具體來說，人造真空的科學(xué)：從浴室拔罐到芯片光刻機(jī)

   

   

更后，這些電子產(chǎn)品與樣品相互作用后，會(huì)攜帶樣品信息，用傳感器收集放大信號(hào)，分析后就可以得到樣品的外觀。剛才的問號(hào)圖其實(shí)是電鏡。

   

   

短波長(zhǎng)電子顯示出明顯的粒子性。電子槍發(fā)出的電子通過電磁透鏡聚集在一起，然后擊中樣品。這些電子和樣品有兩種方式：一種是原路返回，另一種是傲慢的穿越。這兩個(gè)原理對(duì)應(yīng)于兩個(gè)電鏡。

   

掃描電子顯微鏡（SEM）

   

主要有兩種電子：背散射線和二次電子。收集和放大這兩種電子信號(hào)，即SEM成像原理。

   

   

背散射電子是指固體樣品原子反射的部分入射電子，對(duì)樣品成分敏感，如元素類型。

   

二 二級(jí)電子是指被入射電子轟擊的核外電子，對(duì)病毒與環(huán)境的差異等樣品表面形狀敏感。

   

   

這張圖是關(guān)于更近發(fā)布的COVID-19的SEM照片主要依靠二次電子信號(hào)，可以清楚地看到病毒在背景上呼之欲出，具有立體感。

   

值得一提的是，這張SEM圖紙修復(fù)后。

   

據(jù)我所知，目前還沒有電子顯微鏡可以單獨(dú)拍攝彩色圖片，因?yàn)閭鞲衅髦饕獧z測(cè) 電子強(qiáng)度（數(shù)量）信號(hào)，這意味著只能在白色和黑色之間取灰色，不能在白色和黑色之間取紅色、黃色、藍(lán)色和綠色。下圖是真的SEM圖像。

   

   

還是黑白看著順眼？

   

透射電子顯微鏡（TEM）

   

除了原路返回子外，還有直接通過樣品的透射電子。

   

   

考慮到有病毒的地方和沒有病毒的地方的物質(zhì)組成不同，入射電子的散射能力也不同。

   

例如，重元素的原子具有較強(qiáng)的電子散射能力，透射電子無法通過，圖像較暗。同樣的元素，樣品越厚，透射電子就越難通過。這將形成 厚的襯里。

   

通過收集和分析透射電子強(qiáng)度信號(hào)，可以實(shí)現(xiàn)成像。使用此原理的電鏡是TEM。

   

   

這個(gè)也是PS后的

   

   

冠狀病毒看起來仍然很可愛

   

可以看出，相比采集二次電子的SEM，TEM圖像沒有立體感，主要是因?yàn)楹笳卟杉干潆娮?，樣品沿厚度方向平等?/p>    

無論10nm厚度處還是20nm，只要一個(gè)地方有足夠多、足夠重的原子覆蓋電子，這個(gè)區(qū)域更終呈現(xiàn)的圖像就是黑暗的，比如病毒的蛋白質(zhì)外殼。

   

當(dāng)然，部分原因是為了讓透射電子獲得足夠的信號(hào)成像，如果樣品太厚，就會(huì)變黑，所以樣品要減少到100nm在這個(gè)厚度下，立體感很難維持。

   

說到制樣，不得不說SEM和TEM樣品是一個(gè)大學(xué)問題，提取病毒后不能立即拍攝。

   

   

例如，等離子體將被用來鍍金生物樣品

   

部分操作與分子烹飪非常相似，如液氮、真空環(huán)境等，下一篇文章簡(jiǎn)要討論，感興趣歡迎關(guān)注。

   

結(jié)語

   

"It is very easy to answer ** ny fundamental biological questions; you just look at the thing!" Richard Feyn ** n

   

恐懼來自未知，沒有什么比看到敵人更放心了。從視覺識(shí)別、光學(xué)顯微鏡到直接看到COVID-19的SEM和TEM，人類的歷史是求索并創(chuàng)造的史詩。

   

對(duì)病毒，我們已經(jīng)有了比前人更強(qiáng)大的武器，應(yīng)該有足夠的信心，平和而堅(jiān)定地面對(duì)它們。